バイオエコノミー | 広島大学オープンイノベーション本部産学連携部門

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2024.05.08

微生物ガス発酵を用いた基礎化学品（エタノール、アセトン、2-プロパノール）製造によるカーボンリサイクル

背景地球環境問題への対応のため、化石燃料に替えてバイオマス資源を利用し、また、発生する二酸化炭素を化学原料や燃料として再利用するカーボンリサイクルの早期実現が、喫緊の課題となっている。バイオマス資源から糖質のみを抽出して、発酵法により有用な化学物質を合成する手法はあるが、原料が食料と競合、糖以外の有機物が利用困難、糖化処理の高コストなどの弱点がある。バイオマス資源から比較的容易に得られるメタン、水素、一酸化炭素、二酸化炭素などの合成ガスから、有用な化学物質が合成できれば、カーボンリサイクルの自由度が大幅にアップする。ホモ酢酸菌と呼ばれる嫌気性細菌の一群は、合成ガスから酢酸を生成することができる。酢酸以外の有用な化学物質が合成できれば、炭素循環型社会を支える有用技術となる。概要酢酸菌を遺伝子組み換えして基礎化学品（エタノール、アセトン、2-プロパノール）を生産好熱性ホモ酢酸菌の１種Moorella thermoaceticaの野生株は、糖のみならず、CO2、H2、COを原料・エネルギー源として、酢酸を生成する代謝系を持つ。遺伝子組み換えにより、 thermoaceticaが作る中間体アセチル-CoAを材料として、独自開発の遺伝子組換え技術により耐熱性酵素を導入することで、目的の基礎化学品（エタノール、アセトン、2-プロパノール）を生成することに成功した。生産物が低沸点であることを活用し発酵/分離を統合した合成ガス高温発酵プロセスを開発した。合成ガスからの基礎化学品（エタノール、アセトン、2-プロパノール）生成作製した菌は合成ガスを基質として、上記基礎化学品を生産する。菌体当たりの生産速度アセトン： 90 mg/g-菌体/時間（CO:H2比 = 1:1）。すなわち、10ｇ/Ｌの菌体があれば、約1ｇ/Ｌ/ｈの高速アセトン生産が可能になる。 2-プロパノール（アセトン生産経路にアルコール脱水素酵素を追加することで生成）：30 mg/g-菌体/時間エタノール（アルコール脱水素酵素およびエネルギー代謝改善酵素を導入することで生成）：70mg/g-菌体/時間開発した菌は、55℃から65℃で培養可能であり、蒸留発酵により生産物を回収しながら、物質生産を継続でき、分離・精製工程の負荷を低減できる。本研究の優位性化石燃料フリー、さらに、他で発生するCO2を利用して、有用化学物質を生産可能バイオマス資源から糖化プロセスを経て有用化学物質を生産する発酵プロセスに比較して、原料が食料と競合しない糖に限定されず、有機物なら何でも利用可能である。中温微生物による従来プロセスと比較して、発酵しながら分離（蒸留）するので、分離・精製工程の負荷や排水処理コストを低減可能である。バイオマスや廃棄物等から比較的容易に生成可能な合成ガス、火力発電からの二酸化炭素、太陽光や風力発電で生成させた水素等、多様な組み合わせで、フレキシブルに有用化学物質を生産可能である。合成ガスから有用化学物質を生産する既存の化学プロセスと比較して、例えば、メタノール合成プロセスのような高温・高圧の処理やガス組成の厳密な制御を必要としない。期待される用途生成物は有機溶媒として使われるほか、日本のプラスチック生産量の約半分を占めるポリエチレン、ポリプロピレン、C2-C4の化学品の合成前駆体として用いられる。本技術を、バイオマスや廃プラ等による安価な合成ガス、火力発電所等からの二酸化炭素、太陽光や風力等からの水素と組み合わせることにより、今後のマテリアルカーボンリサイクルフロー実現のための重要技術となることが期待される。実用化に向けての課題菌株育種：合成ガスからの目的産物の生産を確認済みだが、酢酸が副生する点が未解決である。また、CO2/H2を原料とした際に生産性が低下する課題が未解決である。プロセス開発：合成ガスおよびCO2/H2を原料とした発酵装置を開発した。しかし、開発アセトン発酵プロセスと、安価な合成ガス原料および製造プロセス、および各種化成品製造プロセスとのインターフェース技術は未確立である。 LCA: 実用化に向けて、高精度なプロセス設計に基づく、LCAおよび経済性評価も必要となる。企業への期待菌株育種：ガス発酵微生物のハイスループット育種技術の共同開発プロセス開発：開発アセトン発酵プロセスと、安価な合成ガス原料および製造プロセス、および各種化成品製造プロセスとの親和性検討とインターフェース技術の共同開発、および詳細プロセス設計に関わる共同研究 LCA: 高精度なプロセス設計に基づく、LCAおよび経済性評価に関わる共同研究本技術に関する知的財産権発明の名称：アセトンを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたアセトンの製造方法出願番号：特願2020- 96417 出願人：国立大学法人広島大学発明者：中島田豊、加藤淳也、加藤節、竹村海正発明の名称：イソプロパノールを生成する組換え好熱性細菌及びそれを用いたイソプロパノールの製造方法出願番号：特願2023-058275 出願人：国立大学法人広島大学発明者：中島田豊, 加藤淳也, 加藤節, 竹村海生, 松尾赳志発明の名称：モーレラ属細菌の遺伝子組換え法特許番号：特許5963538 権利者：国立大学法人広島大学, 国立研究開発法人産業技術総合研究所発明者：酒井伸介, 高岡一栄, 中島田豊,岩崎祐樹, 矢野伸一, 村上克治, 喜多晃久論文 Metabolic engineering of Moorella thermoacetica for thermophilic bioconversion of gaseous substrates to a volatile chemical 国際科学誌「AMB Express」に 2021年23月 23 日にオンライン掲載 Isopropanol production via the thermophilic bioconversion of sugars and syngas using metabolically engineered Moorella thermoacetica 国際科学誌「Biotechnology for Biofuels and Bioproducts」に 2024年1月28 日にオンライン掲載本研究は以下の研究助成を受けて産業技術総合研究所との共同研究により行われた。科学技術振興機構（JST）未来社会創造事業探索加速型「地球規模課題である低炭素社会の実現」領域「「ゲームチェンジングテクノロジー」による低炭素社会の実現」（研究科題名：再生可能エネルギーを活用した有用物質高生産微生物デザイン）研究者からのメッセージ合成ガスや水素など普通の微生物発酵にはなじみのない原料を使う新しい発酵技術です。代謝工学的な微生物育種技術とともに、安全かつ高性能な発酵プロセスの技術開発が必要なチャレンジングな試みです。しかし、本技術が社会実装できれば、微生物発酵は生産物だけではなく菌体そのものもタンパク源となり、物質文明を支える基礎化学品と食糧の併産も可能な夢の技術になりえます。研究者中島田豊（Nakashimada Yutaka）広島大学大学院統合生命科学研究科教授

2022.06.27

シンプル酵素触媒による効率的な有用物質変換

背景従来の微生物細胞による物質生産は、宿主とする微生物を生かしながら行うため、基質・原料が宿主細胞の代謝にも使われ、様々な代謝物質が副産物として生成される。原料が副産物の生成にも使用されるため、目的の物質が低収率となる。不要な副産物生成抑制のために、細胞代謝を改変して最適化する手法がとられるが、これには多大な時間と手間を要す。概要 10～20℃で生育可能な低温菌を宿主として、中温菌の酵素を発現させ、化学品生成経路を構築する。この細胞を中温（40～50℃）で熱処理し、低温菌の代謝酵素を失活させる。これにより、中温菌由来の酵素のみによる物質生産が可能になる。また、熱処理により低温菌細胞が部分的に壊れるため、膜透過性が向上し、原料・基質が細胞内に自由に入ることができ、界面活性剤等の薬品処理が不要になる。本研究の優位性既に実用化されているAspergillus属細菌や、大腸菌を用いた微生物変換法に比べて、不要な副産物の生成がなく、収率が高い。副産物生成抑制のため、従来必要であった細胞代謝の改変が不要となり、多大な時間と手間を省くことができる。基質の膜透過性向上のため、従来必要であった界面活性剤等の薬剤処理が不要となる。中温加熱処理のみで高い生産性と収率が得られる「シンプル酵素触媒」であり、有用物質生産のコスト削減が期待される。期待される用途 ➢応用例１：３-HPA（ヒドロキシプロピオンアルデヒド）の生成３-HPAはグリセロールから変換されるアルデヒドであり、アクリル酸の原料として利用される有用化学品である。廃グリセロールは有用な資源であるにも関わらず活用されていないため、グリセロールを使用して物質変換の検討を行った。細胞を培養・回収・洗浄、熱処理後（45℃・15min）、3-HPAの収率を調査。ほぼ100％の割合で３-HPAに変換できた。 ➢応用例２：1,3-PD（プロパンジオール）の生成 1,3-PDは抗菌性を併せ持つ保湿剤として効果があり、化粧品等に利用されている有用化学品である。応用例１の3-HPA生成系後半にDhaTを導入することにより1,3-PDを生成。 DhaTは還元力を必要とするため、補酵素NADHの添加が必要となるが、FDH（ギ酸デヒドロゲナーゼ）も発現させた細胞を構築することにより、NADH無添加で1,3-PDの生成が可能となり、収率5%で生成した。 ➢応用例３：アスパラギン酸の生成アスパルテームの原料でC４基幹化学品であるアスパラギン酸を、フマル酸から生産した。宿主の代謝酵素による競合反応を熱処理で抑制することにより、副産物のリンゴ酸生成が低下し、収率が向上した。細胞をアルギン酸ナトリウムで固定化することにより、繰り返し利用が可能になり、95％以上の変換効率を９回維持できた。 ➢応用例４：イタコン酸の効率的生産Ｃ５基幹物質のイタコン酸は、コンタクトレンズやニトリル製品などのポリマー素材として有用な化合物である。従来のAspergillus terrusによる生成方法は、合成経路が代謝系と競合すること、合成酵素が異なるオルガネラに分かれていることが課題となっていた。 Shewanella属細菌にアコニターゼ（coli）、cis-アコニット酸脱炭素酵素（Aspergillus terrus）を発現させて培養、回収、洗浄、熱処理後（45℃、15min）、クエン酸を導入、高収率でイタコン酸を生成できた。高収率でイタコン酸を生成し（左のグラフ）、(洗浄操作)を与えなければ、触媒を繰り返し利用して、５回の変換が可能（右のグラフ）である。実用化に向けての課題今後、触媒の安定的利用に関する検討を進めたい。企業への期待酵素機能を最大限発揮可能な本触媒による、物質変換プロセスの実用化を目指す企業との共同研究を希望する。本技術に関する知的財産権発明の名称：低温菌を用いたイタコン酸の製造方法出願番号：特願2018-124796 出願人：国立大学法人広島大学発明者：田島誉久、加藤純一、羅宮臨風論文田島誉久，緋田安希子，加藤純一：低温菌シンプル酵素触媒による効率的な物質変換，Journal of Environmental Biotechnology, 21(1), 9-16, 2021（環境バイオテクノロジー学会誌21巻1号）doi: 10.50963/jenvbio.21.1_9 Mojarrad, T. Tajima, A. Hida, J. Kato: Psychrophile-based simple biocatalysts for effective coproduction of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 85(3), 728-738 (2021) doi: 10.1093/bbb/zbaa081 Mojarrad, K. Hirai, K. Fuki, T. Tajima, A. Hida, J. Kato: Efficient production of 1,3-propanediol by psychrophile-based simple biocatalysts in Shewanella livingstonensis Ac10 and Shewanella frigidimarina DSM 12253, Journal of Biotechnology, 323, 293-301 (2020) doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.09.007 Luo, M. Fujino, S. Nakano, A. Hida, T. Tajima, J. Kato: Accelerating itaconic acid production by increasing membrane permeability of whole-cell biocatalyst based on a psychrophilic bacterium Shewanella livingstonensis Ac10, Journal of Biotechnology, 312, 56-62 (2020) doi:10.1016/j.jbiotec.2020.03.003 Tajima, K. Tomita, H. Miyahara, K. Watanabe, T. Aki, Y. Okamura, Y. Matsumura, Y. Nakashimada, J. Kato: Efficient conversion of mannitol derived from brown seaweed to fructose for fermentation with a thraustochytrid, Journal of Bioscience and Bioengineering, 125(2), 180-184 (2018) doi:10.1016/j.jbiosc.2017.09.002 Tajima, M. Hamada, Y. Nakashimada, J. Kato: Efficient aspartic acid production by a psychrophile-based simple biocatalyst, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 42(10) 1319-1324, (2015) doi:10.1007/s10295-015-1669-7 Tajima, K. Fuki, N. Kataoka, D. Kudou, Y. Nakashimada, J. Kato: Construction of a simple biocatalyst using psychrophilic bacterial cells and its application for efficient 3-hydroxypropionaldehyde production from glycerol, AMB Express, 3(1), 69 (2013) doi: 10.1186/2191-0855-3-69 研究者からのメッセージ本技術は多種多様な酵素の効率的変換を細胞から酵素を抽出せずに容易に実現できるものであり、バイオ変換の生産性向上に有望と考えています。本触媒にご興味がございましたら是非ご連絡ください。研究者田島誉久（TAJIMA TAKAHISA）広島大学大学院統合生命科学研究科准教授

バイオエコノミー

2022.02.08

バイオエコノミー

亜リン酸を用いる遺伝子組換え体の実用的封じ込め

亜リン酸を用いて遺伝子組換え体を封じ込める実用的手法技術の説明生物の必須栄養素であるリンの代謝系を遺伝的に改変し、亜リン酸という天然には存在しない化合物がないと生存できなくなる性質を創り出す技術を開発した。これにより、遺伝子組換え微生物利用の安全性を大きく高め、培養プロセスの経済性向上、開放系利用など新たな可能性を切り拓く有用微生物株の実用化に貢献できる。優位性従来の生物学的封じ込め手法は、効果が弱いか、あるいは高い効果を得るためには非常に複雑な手法や高価な化合物が必要であった。本手法はシンプルであり、大腸菌をはじめとするバクテリアに広く適用可能である。また、培養のコストもかからず、実用向きである。亜リン酸３価のリンを有する通常の生物は利用できない環境中には有効な濃度で存在しない封じ込め株は亜リン酸がないと死滅想定される用途１、微生物を用いたバイオプロセス全般。２、遺伝子組換えによる新たな有用菌株に対して、本手法適用によりGILSP（特殊な培養条件下以外では増殖が制限されること、病原性がないこと等のため、最小限の拡散防止措置を執ることにより使用できる遺伝子組換え微生物）の認定取得。３、さらに封じ込め効果を高めることで、将来的には開放系での利用に展開できる可能性がある。 ➢微細藻類のオープンポンド培養 ➢プロバイオティクス・医療用途 ➢生物を用いた土壌や地下水等の汚染の修復等本技術に関する知的財産権発明の名称：形質転換体、形質転換体の製造方法、および、当該形質転換体を用いた還元型リン化合物の有無の検出方法出願番号：特願2016-170317 出願人：広島大学発明者：廣田隆一、黒田章夫発明の名称：亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法及びその利用出願番号：特許5892621 出願人：広島大学発明者：黒田章夫、廣田隆一発明の名称：亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の製造方法及びその利用出願番号：US特許9273290B2 出願人：広島大学発明者：黒田章夫、廣田隆一実用化に向けた課題株の作製について現在のところ大腸菌のみで実証済。シアノバクテリアにおける実証を進めている。亜リン酸輸送体の機能的発現が重要。Htx輸送体は、グラム陰性のバクテリア以外では、機能しない可能性がある。多くの生物に適合性を高める必要がある。遺伝子破壊系が確立している必要がある。簡便な作製原理を検討中。株の利用について現時点では「遺伝子組換え生物等の第二種使用等」の拡散防止措置が必要。安全評価試験をクリアし、安全性の高さが認められれば、確認申請や拡散防止措置の緩和などが適用される可能性がある。→装置、廃棄プロセスの簡素化が可能になる。人為起源の亜リン酸（農業資材、工業廃棄物）に留意する必要がある。企業への期待実用スケールにおける有効性の実証（微細藻類を希望）封じ込め株の安全性評価の共同試験（大腸菌、微細藻類）研究者廣田隆一（RYUICHI HIROTA）広島大学大学院統合生命科学研究科教授

2022.01.20

難溶性リン可溶化細菌の植物種子・根圏定着能の改良

研究の背景肥料の三要素の一つであるリン肥料資源は、全量輸入に依存する戦略資源のため、肥料価格の高騰を招く。リン肥料は、土壌中でリン酸カルシウムのような難溶性リン等になる。多くの植物はリン酸カルシウムを上手に利用できず、リン利用効率は低くなるため、難溶性リンの利用性を高めることが出来れば、リン減肥栽培やリン肥料資源の節約に繋がる。リン酸カルシウムを可溶化する難溶性リン可溶化細菌や、病害を防除する拮抗細菌といった植物の生育に有益な細菌「植物生育促進細菌」が有効だが、植物種子・根圏に定着せず、有効に機能しない。（共生関係を築かない。）細菌が定着しなければ、その効果は発揮されない。概要植物生育促進細菌の実用化のため、植物の種子・根圏での細菌の定着能の向上かつ一定の細菌数を維持すべく、細菌の※バイオフィルム形成に着目した。 ※バイオフィルム細菌が生産・放出する粘性多糖類に細菌自身が取り込まれた膜状構造物。例）台所のヌメリ、川底の石など難溶性リン可溶化細菌の遺伝的改良１．難溶性リン（リン酸カルシウム）可溶化細菌を単離して検定し、リン酸カルシウム可溶化能が高い細菌Ｘ株を特定。２．細菌X株を遺伝的に改良して、バイオフィルム形成能が高くなった細菌株を選抜。３．選抜された株によるバイオフィルム形成能を評価した結果、MT-5株のバイオフィルム形成量が最も多かった。バイオフィルム形成能が高くなった改良型細菌株（MT-5）とイネ種子を24時間共培養して、その後激しく洗浄し、付着細菌数の変化を２度に渡り調査した。その結果、MT-5株ではイネ種子での定着能が向上した。本研究の優位性植物生育促進細菌など有効な細菌を、その細菌の植物との共生能に関わらず、様々な植物種に定着させることができるようになり、持続的な生育促進効果が期待できる。種子コーティング技術との組み合わせにより、さらなる効果アップが期待される。想定される用途土壌に蓄積された難溶性リンの可溶化を促進することが期待されるため、減肥栽培に利用。（肥料コスト削減）低リン土壌における作物栽培。植物種子・根圏での定着能の改良技術は、他の非共生型の植物生育促進細菌（拮抗細菌、植物ホルモン産生細菌など）にも応用可能。実用化に向けての課題難溶性リン可溶化細菌の植物の種子・根圏での定着能の向上については開発済みだが、定着能のさらなる改良は継続して実施する。どのような植物種や土壌で最も効果的なのか、使用条件の最適化が必要となる。種子表面に難溶性リン可溶化細菌をコーティングして普及させたいので、最適なコーティング方法の検討をする。企業への期待以下の技術を保有あるいは開発・改良を行う企業との共同研究を希望。優れた種子コーティング技術減肥に有効な資材の開発非共生型の植物生育促進細菌（拮抗細菌など）の植物種子・根圏定着能の改良本技術に関する知的財産権発明の名称：新規微生物及びその作成方法出願番号：特願2018-505856（特許第6952349号）出願人：広島大学発明者：上田晃弘論文植物生育促進細菌の実用化に向けた試み上田晃弘、大戸貴裕、近藤もも、大村尚土と微生物 73: 5-9. (2019) Identification of the genes controlling biofilm formation in the plantcommensal Pseudomonas protegens Pf-5 Ueda A, Ogasawara S, Horiuchi K Archives of Microbiology 202: 2453-2459 (2020) 研究者からのメッセージ持続的な農作物生産には肥料資源をかしこく使う必要があります。微生物の力を使って、土壌中に蓄積された未利用の肥料資源を有効に活用するための研究を行っています。研究者上田晃弘（UEDA AKIHIRO）広島大学大学院統合生命科学研究科教授

2020.10.21

低コストで大量繁殖・飼育ができる新規実験動物

目標・狙い “カエル”はヒトと同じ脊椎動物に属する両生類の代表として、古くから実験に用いられてきた。現在では大量飼育が容易なツメガエルが主に用いられてきた。実験動物にはそれぞれの特徴や性質があるので、カエル類を使った実験や研究では不十分な場合もある。我々は、カエルと同じ両生類に属するイモリを実験動物として整備することで、両生類を用いた実験システムの充実化や利便性の向上を目指している。想定される市場・製品・産業分野カエルと同じ両生類の実験動物材料として、以下の分野における活用農薬業界医薬品開発毒性・環境評価概要脊椎動物であるイモリは実験動物としての有用性は認められていたものの、従来の種は大量繁殖が不可能であり、利便性が低い動物とされていた。本研究では、年間数千個もの卵を産卵するイベリアトゲイモリに着目。ホルモン処理による一年中の産卵や人工授精法を確立した。イベリアトゲイモリは文献的には性成熟に1年半以上かかるとされていたが、飼育条件（給餌、水温など）を変えることにより生育速度を早め、雄は6ヶ月、雌は9ヶ月までに短縮すると同時に、大量のイモリを安定的に飼育する技術を開発した。その結果、カエル類を補完あるいは代替する実験動物としての利用が可能となった。本研究の優位性有尾両生類（イモリやサンショウウオ類）において、低コストで大量繁殖・飼育ができる唯一の実験動物。ゲノム編集技術との相性が良いため、実験目的に合わせた遺伝子の改変が可能。論文 Matsunami et al. “A comprehensive reference transcriptome resource for the Iberian ribbed newt Pleurodeles waltl, an emerging model for developmental and regeneration biology.” DNA Res. (2019) 26:217-229. doi: 10.1093/dnares/dsz003.PMID: 31006799 Suzuki et al. “Cas9 ribonucleoprotein complex allows direct and rapid analysis of coding and noncoding regions of target genes in Pleurodeles waltl development and regeneration.” Dev Biol. (2018) 443:127-136. doi: 10.1016/j.ydbio.2018.09.008 Hayashi et al. “Molecular genetic system for regenerative studies using newts.” Dev Growth Differ. (2013) 55:229-36. doi: 10.1111/dgd.12019 外部資金の獲得状況住友財団基礎科学研究助成内藤記念科学奨励金・助成金科研費2019〜2021年度基盤研究(C)（代表）科研費2019〜2021年度基盤研究(C)（分担）他研究者からのメッセージイベリアトゲイモリを安定的に飼育する技術の開発により、カエル類を補完あるいは代替する実験動物としての利用が可能となりました。イベリアトゲイモリを介した研究にご興味のある企業の方は是非一度ご相談ください。研究者林利憲（HAYASHI TOSHINORI）広島大学両生類研究センター教授

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亜リン酸を用いる遺伝子組換え体の実用的封じ込め

難溶性リン可溶化細菌の植物種子・根圏定着能の改良

低コストで大量繁殖・飼育ができる新規実験動物